Andy, que ahora tiene 17 años, se prepara para irse a la universidad. Lleva años sin jugar con sus juguetes, y solo quedan Woody, Buzz Lightyear, Jessie, Bullseye, Rex, Slinky, Hamm, el Sr. y la Sra. Patata, los Aliens y tres soldados de juguete. Mientras los abatidos juguetes reflexionan sobre su futuro, los soldados se lanzan en paracaídas por la ventana y se marchan.
Andy tiene la intención de llevar a Woody a la universidad, y mete a los demás juguetes en una bolsa de basura, para colocarlos en el desván; sin embargo, la madre de Andy coloca por error la bolsa fuera, con la verdadera basura. Los juguetes escapan por los pelos del camión de la basura y, creyendo que Andy los ha tirado deliberadamente, se meten en una caja de donaciones del coche de la madre de Andy con la vieja muñeca Barbie de Molly.
Woody le sigue en un intento de traerlos de vuelta, pero es incapaz de convencer a los demás de las verdaderas intenciones de Andy, y le sigue la corriente cuando la madre de Andy lleva la caja de donaciones a la guardería Sunnyside.
En Sunnyside, los juguetes de Andy son recibidos por los demás juguetes, liderados por el oso
Lots-O'-Huggin' ("Lotso"). Los juguetes (excepto Woody) están encantados de saber que Sunnyside nunca se queda sin niños, y Barbie está enamorada de un muñeco Ken. Woody intenta volver a casa, pero es encontrado por una niña de Sunnyside llamada
Bonnie, que se lo lleva a casa y juega con él y con sus otros juguetes.
Los juguetes de Bonnie se sorprenden de que Woody se haya escapado de Sunnyside.
Chuckles, un payaso de juguete, explica que él, Lotso y
Big Baby, el ayudante de Lotso en Sunnyside, eran propiedad de una niña llamada Daisy, pero que se perdieron durante un viaje familiar. Cuando llegaron a casa, Lotso descubrió que había sido sustituido.
Haciendo caso omiso de las protestas de Chuckles, el amargado Lotso mintió a Big Baby diciéndole que Daisy los había sustituido a todos. Montaron en un camión hasta Sunnyside, donde Lotso tomó el control, convirtiéndola en una prisión de juguete. Al final Chuckles se rompió y fue encontrado por Bonnie.
Mientras tanto, de vuelta en Sunnyside, después de que los niños pequeños jueguen bruscamente con los juguetes de Andy, Buzz le pide a Lotso que traslade los juguetes a la habitación de los niños mayores. Lotso permite que Buzz se vaya, pero cuando insiste en que los juguetes de Andy también se vayan, Lotso cambia a Buzz a su configuración original de fábrica en modo demo, haciendo que se crea un auténtico Ranger espacial bajo las órdenes de Lotso.
Mientras tanto, la Sra. Patata, a través de un ojo que perdió en la habitación de Andy, ve a este buscando sus juguetes. Se dan cuenta de que Woody dijo la verdad sobre las intenciones de Andy e intentan escapar, pero la banda de Lotso, ahora ayudada por Buzz, al que le han lavado el cerebro, los encarcela.
Woody regresa a Sunnyside, donde un Teléfono Parlanchín le dice que ya no hay salida, excepto por el conducto de la basura. Más tarde, esa noche, los juguetes elaboran su plan de escape. Después de incapacitar con éxito al vigilante nocturno de Lotso, que es un mono de juguete que toca el címbalo, intentan restaurar la memoria de Buzz, pero Rex accidentalmente restablece a Buzz al modo español.
Buzz en español, creyéndose todavía un auténtico guardabosques espacial, se alía inmediatamente con Woody y se enamora de Jessie. Los juguetes llegan a un contenedor, pero son acorralados por Lotso y su banda. Woody revela el engaño de Lotso a Big Baby, quien, enfadado, arroja a Lotso al contenedor. Cuando se acerca un camión de la basura, los juguetes intentan marcharse, pero Lotso empuja a Woody al contenedor. El resto de los juguetes de Andy saltan tras él cuando llega el camión, y todos caen dentro.
Buzz vuelve a la normalidad después de que le caiga encima un televisor dentro del camión. El camión lleva los juguetes a un vertedero, donde son arrastrados a una cinta transportadora que conduce a un incinerador. Los Aliens ven una garra industrial, pero son arrastrados mientras corren hacia ella. Tras evitar por los pelos una trituradora y rescatar a Lotso, Woody y Buzz le ayudan a alcanzar un botón de parada de emergencia, pero Lotso les abandona.
Los juguetes caen en la incineradora y se resignan a su aparente destino, pero los Aliens los rescatan con la garra industrial. Más tarde, Lotso es encontrado por el conductor de un camión de la basura, que lo sujeta a la rejilla del radiador de su camión como decoración. Woody y sus amigos vuelven en otro camión de la basura a casa de Andy.
Woody deja una nota a Andy, quien, pensando que la nota es de su madre, dona los juguetes a Bonnie. Andy presenta los juguetes individualmente a Bonnie y se sorprende al encontrar a Woody en el fondo de la caja de donaciones. Bonnie lo reconoce y, aunque al principio duda, Andy le pasa a Woody y juegan juntos antes de que él se marche. Woody y los demás juguetes son testigos de la marcha de Andy mientras comienzan su nueva vida con Bonnie.
En el epílogo de la película, Barbie, Ken y Big Baby han mejorado enormemente Sunnyside y mantienen el contacto con los juguetes de Bonnie a través de cartas. Los soldados de juguete llegan en paracaídas a Sunnyside, donde Ken y Barbie les dan la bienvenida.